Mario
Debido a ello, cuando se oye hablar de Super Mario, comúnmente se relaciona con el fontanero con bigote, que viste camisa roja, pantalones azules con tirantes y realiza saltos descomunales. Cuando coge un champiñón se transforma en Super Mario —aumenta de tamaño—, cuando coge una flor de fuego, en Fire Mario —adquiere la capacidad de lanzar bolas de fuego—, y cuando coge una estrella se vuelve invencible ante los ataques, pero solo por un tiempo limitado.
Luigi
Luigi, al igual que su hermano Mario, se encarga de rescatar a la Princesa Peach. En este caso, aparece como segundo personaje, seleccionable para el segundo mando. Posee habilidades similares a las de Mario, diferenciándose en el color de su traje: sombrero y camisa interior verde y mono gris. Cuando adquiere una flor, su traje es igual que el de Fire Mario, pero cambiando el rojo por el verde.
Princesa Peach
Peach sólo aparece al final del juego tras derrotar al último Koopa. Usa un vestido rosa y una corona sobre su cabello pelirojo, el cual en versiones posteriores sería cambiado a rubio.
Rey Koopa
Rey Koopa, conocido también como Bowser es el archienemigo de la serie. Una tortuga antropomorfa más grande que un humano, quien invade el Reino Champiñón para apoderarse de él.
En el juego, el Rey Koopa aparece al final del cuarto nivel de cada mundo del juego. En estas áreas, Mario o Luigi deben tomar un hacha situada detrás del Rey Koopa, con la cual cortan el puente enviándolo a la lava. En los 7 primeros encuentros el ataque por bolas de fuego —otro modo de vencerlo— convertía al Rey Koopa en un enemigo menor, dándose a entender que el bandido original era el del octavo mundo y los otros siete, sólo súbditos disfrazados, como un Goomba, un Hammer Bro, un Lakitu, etc...
Otros personajes
- Toad: es un habitante y guardián del Reino Champiñón. Aparece al final de los 7 primeros castillos, mostrando la conocida frase:
Thank you Mario! But our princess is in another castle. (¡Gracias Mario! Pero nuestra princesa está en otro castillo).
- Goomba: los primeros enemigos en aparecer. Son unas setas de color café. Se les vence al saltar una vez sobre ellos, lanzarles bolas de fuego o con una estrella, lo que los hace los enemigos más fáciles de matar.
- Koopa Troopa : son seres parecidos a tortugas, pertenecientes al ejército Koopa. Como son el más bajo rango de los miembros del ejército, sólo patrullan a pie sus zonas asignadas. Pueden ser utilizados como proyectiles después de hacer que se escondan en sus caparazones —saltando una vez para que se escondan, dos para lanzarlos—. En el juego aparecen dos tipos de Troopas: los verdes, que sólo siguen un sentido y no lo cambian al menos que se choquen con un obstáculo; y los rojos, que al llegar a un precipicio cambian de sentido (también cuando chocan con un obstáculo). Cuando un caparazón no está en la pantalla, se desvanece. También hay unos que poseen alas (verdes y rojos), pero sólo pueden ascender a una altura determinada —otros por lo que en lugar de volar, simplemente saltan — conocidos como Paratroopa o Parakoopa . Éstos también pueden ser utilizadas como proyectiles, — saltando una vez pierden sus alas, dos para que se , tres para lanzarlos. Al igual como los que no tienen alas, los verdes siguen sólo siguen un sentido y no lo cambian amenos que choquen con un obstáculo, y los rojos que sí lo cmabian al chocar con un precipicio (también si chocan con un obstáculo). Ambas clases (con alas y sin alas) y y tipos (verdes y rojos) son vencidos automáticamente con la bola de fuego o con una estrella.
- Lakitu : también del ejército Koopa, se asemejan a los Koopa Troopa, con la diferencia de que éstos son más pequeños, usan gafas y vuelan sobre una nube sonriente con líneas verdes. Su característica principal es arrojar pequeñas tortugas con caparazón de pinchos, llamados Spiny . Se puede vencer a Lakitu saltando sobre él, con bolas de fuego o con una estrella; a diferencia de los Spiny, sobre los que no se puede saltar por tener pinchos, por lo que para matar a un Spiny, hay que atacarle con una bola de fuego o con una estrella.
- Planta piraña : enemigo que se parece a una trampa para moscas y que emerge de las tuberías. Suele ascender y descender periódicamente. Se les vence con bolas de fuego, como a Bowser y a los enemigos regulares o con una estrella, como a todos. Cuando Mario o Luigi se encuentran junto a la tubería, esta planta no aparece hasta que se le alejen.
- Podoboo : aparece en las fases de castillo. Son bolas de fuego vivientes que saltan de la lava periódicamente.
- Hammer Bros: de apariencia similar a los Koopa Troopa, con la diferencia de que estos usan armaduras y que estos no avanzan lateralmente, sino que saltan y lanzan martillos, para acabar con ellos, hay que aplastarlos{ atacarlos con bolas de fuego o con una estrella.
- Buzzy Beetle : criatura amarilla con un caparazón negro. Son inmunes a las bolas de fuego, pero pueden ser derrotados de manera similar a los Koopa Troopa: saltando sobre ellos y empujándolos cayendo a un abismo como a los verdes, perdiéndolos de la pantalla, o con una estrella (con esta última se los derrota automáticamente).
- Bullet Bill: grandes misiles de color negro parecidos a las bombas Fat Man, que son lanzados desde los cañones Bill Blasters, al igual que los Buzzy Beetle, son inmunes a las bolas de fuego, pero pueden ser derrotados saltando sobre éstos o con una estrella.
- Criaturas marinas: durante las fases acuáticas aparecen una serie de enemigos que, al igual que los anteriores, con sólo el contacto, Mario pierde una vida. Éstos son:Blooper (ゲッソー Gessō?, similar a un calamar) y Cheep Cheeps (プクプク Pukupuku?, similar a un pez). Los Blooper y los Cheep Cheeps son derrotados únicamente lanzándoles bolas de fuego. Sin embargo, los Cheep Cheeps también pueden aparecer en lugares sin agua y en este caso la única manera de derrotarlos es saltando sobre ellos, lanzándole bolas de fuego o con una estrella. En el juego hay dos tipos de Cheep Cheeps: los rojos que aparecen tanto en el agua como fuera de ella y se mueven con rapidez, y los grises que sólo aparecen en el agua y se mueven con lentitud.
